Izdelki

Analiza fosforilacijskih dogodkov na celotnem proteomu je še vedno velik analitični izziv zaradi ogromne kompleksnosti proteinskih fosforilacijskih mrež.V tem delu ocenjujemo komplementarnost Lys-N, Lys-C in tripsina glede na njihovo sposobnost prispevanja k globalni analizi fosfoproteoma.Za učinkovito ločevanje acetiliranih, fosforiliranih in nemodificiranih peptidov na N-koncu je bila uporabljena rafinirana različica močne kationske izmenjave z nizkim pH.Skupaj 5036 neredundantnih fosfopeptidov je bilo mogoče identificirati s stopnjo lažnega odkritja <1 % iz 1 mg beljakovin z uporabo kombinacije treh encimov.Naši podatki so razkrili, da je bilo prekrivanje med nabori podatkov o fosfopeptidih, ustvarjenimi z različnimi proteazami, zanemarljivo, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je prekrivanje med dvema podobno ustvarjenima nizoma triptičnih podatkov vsaj 4-krat večje.Na ta način je vzporedna uporaba Lys-N in tripsina omogočila 72-odstotno povečanje števila odkritih fosfopeptidov v primerjavi s samim tripsinom, medtem ko je eksperiment s ponovitvijo tripsina povzročil le 25-odstotno povečanje.Tako smo, ko smo se osredotočili samo na podatke o tripsinu in Lys-N, identificirali 4671 neredundantnih fosfopeptidov.Nadaljnja analiza odkritih mest je pokazala, da so bili nabori podatkov Lys-N in tripsina obogateni s precej različnimi fosforilacijskimi motivi, kar dodatno dokazuje, da so multiproteazni pristopi zelo dragoceni pri analizah fosfoproteomov.