Izdelki

Fosforilacija beljakovin uravnava različne celične funkcije in ima ključno vlogo pri zgodnjem razvoju rastlin.Za dopolnitev in razširitev prejšnjih raziskav fosforilacije beljakovin v sadikah Arabidopsis smo uporabili alternativni pristop, ki združuje ekstrakcijo beljakovin v pogojih brez denaturacije z obogatitvijo afinitetne kromatografije z imobiliziranimi kovinskimi ioni (IMAC) nepoškodovanih fosfoproteinov v ekstraktih, osiromašenih z Rubiscom, čemur je sledila identifikacija z uporabo dvodimenzionalne gelske elektroforeze (2-DE) in tekočinske kromatografije-tandemske masne spektrometrije (LC-MS/MS).Prebava tripsina v gelu in analiza izbranih gelskih madežev je identificirala 144 fosforiliranih peptidov in ostankov, od katerih je bilo najdenih samo 18 fosfopeptidov in 8 fosfozitov v bazah podatkov fosforilacijskih mest PhosPhAt 4.0 in P3DB Arabidopsis thaliana.Več kot polovica od 82 identificiranih fosfoproteinov je bila vključena v presnovo ogljikovih hidratov, fotosintezo/dihanje ali mehanizme odziva na oksidativni stres.Zdi se, da obogatitev nedotaknjenih fosfoproteinov pred 2-DE in LC-MS/MS izboljša detekcijo fosforiliranih ostankov treonina in tirozina v primerjavi z metodami, ki uporabljajo obogatitev na ravni peptidov, kar kaže na to, da se oba pristopa nekoliko dopolnjujeta v smislu pokritosti mesta fosforilacije.Primerjava rezultatov za mlade sadike s predhodno pridobljenimi rezultati za zrele liste Arabidopsis je identificirala pet proteinov, ki so različno fosforilirani v teh tkivih, kar kaže na potencial te tehnike za raziskovanje dinamike fosforilacije proteinov med razvojem rastline.