novice

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog substrata β-galaktozidaze, ki je visoko inducibilen.Pod indukcijo IPTG lahko induktor tvori kompleks z represorskim proteinom, tako da se konformacija represorskega proteina spremeni, tako da ga ni mogoče kombinirati s ciljnim genom, ciljni gen pa se učinkovito izraža.Kako naj se torej določi koncentracija IPTG med poskusom?Ali je večji, tem boljši?
Najprej razumejmo načelo indukcije IPTG: laktozni operon (element) E. coli vsebuje tri strukturne gene, Z, Y in A, ki kodirajo β-galaktozidazo, permeazo in acetiltransferazo.lacZ hidrolizira laktozo v glukozo in galaktozo ali v alolaktozo;lacY omogoča, da laktoza v okolju preide skozi celično membrano in vstopi v celico;lacA prenese acetilno skupino iz acetil-CoA na β-galaktozid, kar vključuje odstranitev toksičnega učinka.Poleg tega obstaja operativno zaporedje O, začetno zaporedje P in regulatorni gen I. Genska koda I je represorski protein, ki se lahko veže na položaj O operaterskega zaporedja, tako da je operon (meta) potlačen in ugasnjen.Obstaja tudi vezavno mesto za vezavno mesto proteina aktivatorja katabolnega gena-CAP pred začetnim zaporedjem P. Zaporedje P, zaporedje O in vezavno mesto CAP skupaj sestavljajo regulativno regijo lac operona.Gene, ki kodirajo tri encime, uravnava ista regulativna regija, da se doseže usklajeno izražanje genskih produktov.

V odsotnosti laktoze je lac operon (meta) v stanju represije.V tem času se lac represor, izražen s sekvenco I pod nadzorom sekvence promotorja PI, veže na sekvenco O, kar preprečuje, da bi se RNA polimeraza vezala na sekvenco P, in zavira začetek transkripcije;ko je prisotna laktoza, se lahko inducira lac operon (meta). V tem sistemu operona (meta) pravi induktor ni laktoza sama.Laktoza vstopi v celico in jo katalizira β-galaktozidaza, da se pretvori v alolaktozo.Slednji se kot induktorska molekula veže na represorski protein in spremeni konformacijo proteina, kar vodi do disociacije represorskega proteina od zaporedja O in transkripcije.Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima enak učinek kot alolaktoza.Je zelo močan induktor, ki ga bakterije ne presnavljajo in je zelo stabilen, zato se pogosto uporablja v laboratorijih.

Kako določiti optimalno koncentracijo IPTG?Vzemimo E. coli kot primer.
Gensko spremenjeni sev E. coli BL21, ki vsebuje pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT), je bil inokuliran v tekoči medij LB, ki je vseboval 50 μg·mL-1 Amp, in gojen čez noč pri 37 °C.Zgornjo kulturo smo inokulirali v 10 steklenic s 50 ml svežega tekočega medija LB, ki je vseboval 50 μg·mL-1 Amp v razmerju 1:100 za ekspanzijsko kulturo, in ko je bila vrednost OD600 0,6~0,8, smo končni koncentraciji dodali IPTG.To je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol · L-1.Po indukciji pri enaki temperaturi in ob istem času smo iz nje odvzeli 1 ml bakterijske raztopine in bakterijske celice zbrali s centrifugiranjem ter jih podvrgli SDS-PAGE, da bi analizirali vpliv različnih koncentracij IPTG na izražanje beljakovin, nato pa izberite koncentracijo IPTG z največjo ekspresijo beljakovin.
Po poskusih bo ugotovljeno, da koncentracija IPTG ni čim večja.To je zato, ker ima IPTG določeno toksičnost za bakterije.Prekoračitev koncentracije bo tudi ubila celico;in na splošno upamo, da bolj ko je topna beljakovina izražena v celici, tem bolje, toda v mnogih primerih, ko je koncentracija IPTG previsoka, bo nastala velika količina vključkov.Telo, vendar se je količina topnih beljakovin zmanjšala.Zato najprimernejša koncentracija IPTG pogosto ni čim večja, tem bolje, temveč nižja koncentracija.
Namen indukcije in gojenja gensko spremenjenih sevov je povečati izkoristek ciljne beljakovine in zmanjšati stroške.Na ekspresijo ciljnega gena ne vplivajo le lastni dejavniki seva in ekspresijski plazmid, temveč tudi drugi zunanji pogoji, kot so koncentracija induktorja, indukcijska temperatura in indukcijski čas.Zato je na splošno, preden se neznani protein izrazi in očisti, najbolje preučiti čas indukcije, temperaturo in koncentracijo IPTG, da izberemo ustrezne pogoje in pridobimo najboljše eksperimentalne rezultate.