Izdelki

Razumevanje metabolizma mikrobnega gostitelja je bistvenega pomena za razvoj in optimizacijo biokatalitskih procesov, ki temeljijo na celotni celici, saj narekuje učinkovitost proizvodnje.To še posebej velja za redoks biokatalizo, kjer se uporabljajo presnovno aktivne celice zaradi regenerativne sposobnosti kofaktorja/kosubstrata, ki je endogena v gostitelju.Rekombinantna Escherichia coli je bila uporabljena za čezmerno proizvodnjo prolin-4-hidroksilaze (P4H), dioksigenaze, ki katalizira hidroksilacijo prostega L-prolina v trans-4-hidroksi-L-prolin z a-ketoglutaratom (a-KG) kot kosubstratom.V tem celoceličnem biokatalizatorju osrednji metabolizem ogljika zagotavlja zahtevani kosubstrat a-KG, ki povezuje biokatalitično delovanje P4H neposredno s presnovo ogljika in presnovno aktivnostjo.Z uporabo eksperimentalnih in računalniških bioloških orodij, kot sta presnovni inženiring in analiza (13)C-metaboličnega toka ((13)C-MFA), smo raziskali in kvantitativno opisali fiziološki, presnovni in bioenergetski odziv celoceličnega biokatalizatorja do ciljne biokonverzije in identificirala možna presnovna ozka grla za nadaljnji racionalni inženiring poti. Sev E. coli s pomanjkanjem razgradnje prolina je bil konstruiran z brisanjem gena putA, ki kodira prolin dehidrogenazo.Celocelične biotransformacije s tem mutantnim sevom niso vodile le do kvantitativne hidroksilacije prolina, ampak tudi do podvojitve specifične hitrosti tvorbe trans-4-L-hidroksiprolina (hyp) v primerjavi z divjim tipom.Analiza pretoka ogljika skozi osrednji metabolizem mutantnega seva je pokazala, da povečano povpraševanje po a-KG po aktivnosti P4H ni povečalo pretoka, ki ustvarja a-KG, kar kaže na strogo regulirano delovanje cikla TCA pod proučevanimi pogoji.V sevu divjega tipa sta sinteza in kataliza P4H povzročili zmanjšanje donosa biomase.Zanimivo je, da je sev ΔputA dodatno kompenziral povezano izgubo ATP in NADH z zmanjšanjem potreb po vzdrževalni energiji pri primerljivo nizkih stopnjah privzema glukoze, namesto da bi povečal aktivnost TCA. Ugotovljeno je bilo, da je izločitev putA v rekombinantni E. coli BL21(DE3)(pLysS) obetaven za produktivno katalizo P4H ne le v smislu izkoristka biotransformacije, temveč tudi glede hitrosti biotransformacije in privzema prolina ter izkoristka hyp na viru energije.Rezultati kažejo, da postane po izločitvi putA povezovanje cikla TCA s hidroksilacijo prolina prek kosubstrata a-KG ključni omejevalni dejavnik in tarča za nadaljnje izboljšanje učinkovitosti od a-KG odvisnih biotransformacij.