Izdelki

Nov test s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti za glikoziltransferaze, ki temelji na derivatizaciji z antranilno kislino in detekciji fluorescence.

Testi so bili razviti z uporabo edinstvene kemije označevanja 2-aminobenzojske kisline (2AA; antranilne kisline, AA) za merjenje aktivnosti tako β1-4 galaktoziltransferaze (GalT-1) kot α2-6 sialiltransferaze (ST-6) z visoko zmogljivo tekočino kromatografija (HPLC) s fluorescenčno detekcijo (Anumula KR. 2006. Napredek v metodah fluorescenčne derivatizacije za visoko zmogljivo tekočinsko kromatografsko analizo glikoproteinskih ogljikovih hidratov. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglukozamin (GlcNAc) in N-acetillaktozamin sta bila uporabljena kot akceptorja, uridin difosfat (UDP)-galaktoza in citidin monofosfat (CMP)-N-acetilnevraminska kislina (NANA) pa kot donorji za GalT-1 oziroma ST-6.Encimske produkte smo in situ označili z AA in jih ločili od substratov na koloni TSKgel Amide 80 z uporabo normalnih faznih pogojev.Encimske enote so bile določene iz površin vrhov v primerjavi s sočasno derivatiziranima standardoma Gal-β1-4GlcNAc in NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Ugotovljena je bila linearnost (čas in koncentracija encima), natančnost (znotraj in med preskusi) in ponovljivost za teste.Ugotovljeno je bilo, da so testi koristni pri spremljanju aktivnosti encimov med izolacijo in čiščenjem.Testi so bili zelo občutljivi in ​​izvedeni enako ali bolje kot tradicionalne meritve na osnovi radioaktivnega sladkorja.Format testa se lahko uporablja tudi za merjenje aktivnosti drugih transferaz, pod pogojem, da akceptorji ogljikovih hidratov vsebujejo redukcijski konec za označevanje.Test za akceptorje glikoproteina je bil razvit z uporabo IgG.Za ločevanje glikanov IgG (biantenarni G0, G1, G2, mono- in disialilirani) je bila razvita kratka metoda profiliranja HPLC, ki je omogočila hitro določanje aktivnosti GalT-1 in ST-6.Poleg tega bi se morala ta metoda profiliranja izkazati za uporabno za spremljanje sprememb glikanov IgG v kliničnih okoljih.